络病与心脑血管疾病相关性及治疗研究进展

通心络对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经干细胞增殖分化的影响(二)

4.结果的判定

BrdU标记法 各组大鼠于处死前两天即造模后第1、2天,第5、6天,第12、13天,第19、20天时分别腹腔注射BrdU生理盐水液(sigma),按100mg/kg体重的量,每日给药两次,间隔8h。

脑组织切片制备 各组大鼠于末次腹腔注射BrdU后24h,在10%水合氯醛麻醉下,迅速断头取脑,放入特制的小盒内,缓缓平放入盛有液氮的小杯中,当盒底接触液氮时即开始气化沸腾,10~20min后脑组织迅速冰结成块,取出脑组织冰块立即置入恒温箱切片机冷冻切片。参考《大鼠脑立体定向图谱》,以前卤后0.3~1.2mm为侧脑室;前卤后3.14~4.52mm为海马区部位,连续冠状切片,切片以0.1%多聚赖氨酸处理,每张脑片厚8μm,所得切片依次入4%多聚甲醛固定15min后,吹干,置4℃冰箱中备用。

BrdU与β-Tubulin、BrdU与GFAP免疫荧光双标染色法 分别取每只大鼠相邻的SVZ、DG区脑片各8张,参考鸡尾酒法按以下步骤行免疫荧光染色:将脑片入2mol/L HCL中30min(37℃);30.1M硼酸缓冲液(pH8.4)洗10min;0.2%H2O2放置30min;脑片上分别加入正常血清封闭液,即正常山羊血清、正常山羊血清+正常兔血清60min后甩去多余的血清,不以PBS冲洗;再分别加一抗:小鼠抗大鼠 BrdU IgG(1:50)和兔抗大鼠β-Tubulin IgG(1:100)或山羊抗大鼠 GFAP IgG(1:100)混和液,湿盒中4℃孵育72h。洗后再分别加二抗:山羊抗兔 IgG-TRITC(1:100)+山羊抗小鼠IgG-FITC(1:20),或兔抗山羊 IgG-TRITC(1:100)+山羊抗小鼠IgG-FITC(1:20),避光,湿盒中室温孵育3h。磷酸缓冲液(PBS)冲洗两次,缓甘油封片,避光保存,即送激光共聚焦显微镜下观察。

各组另取两张片为阴性对照,一张不加入一抗,另一张不加入二抗,余步骤同上。

上述各图片在激光共聚焦显微镜统一放大倍数(10×20)下,设置相等的检测窗口面积,随机选10个阳性细胞区域,分别测其缺血侧DG、SVZ区阳性细胞的荧光强度值并求均值,作为此张片的阳性细胞荧光强度值。

统计学处理

所得数据输入计算机用SPSS10.0软件进行统计处理。检测数据以x±s表示,作单因素方差分析和t 检验。

结 果

1.大鼠脑缺血再灌注后各时段活动情况

大鼠脑缺血再灌注后各个时间段活动较正常组减少,体重减轻。免疫组化双标图片显示,各时段对照组BrdU阳性细胞主要分布在缺血侧皮质、DG、SVZ、脉络丛上皮细胞等;部分BrdU阳性细胞同时呈β-Tubulin、GFAP染色阳性;随缺血再灌注时间的延长,荧光强度值增加,其中造模后第7天大鼠DG区BrdU阳性细胞荧光强度值最高,与其他时间点相比,差异极显著(P<0.001);第14天时SVZ、脉络丛上皮细胞的BrdU阳性细胞荧光强度值最高,与其他时间点相比,差异极显著(P<0.001);但造模后第21天时,BrdU阳性细胞荧光强度和BrdU+β-Tubulin、BrdU+GFAP免疫双标荧光强度值下降,但仍高于第3天时的强度值,差异显著(P<0.005)。同时发现,各时间段缺血侧SVZ、脉络丛上皮细胞BrdU+GFAP免疫双标荧光强度值高于DG区的荧光强度值;而DG区的BrdU+β-Tubulin免疫双标荧光强度值高于SVZ、脉络丛上皮细胞的荧光强度值,且均在第14天时强度最高。表明在海马颗粒层和齿状回增生的干细胞大部分分化为神经元,而在SVZ、脉络丛上皮细胞增生的干细胞大部分分化为星形胶质细胞。

2.通心络对脑缺血再灌注大鼠不同时间段NSC增殖分化的影响

实验观察到,给予通心络干预后,第3天缺血侧DG、SVZ的BrdU阳性细胞荧光强度值(表1)和BrdU+β-Tubulin(表2)、BrdU+GFAP免疫组化双标荧光强度值(表3)与模型对照组相比无显著差异。通心络干预后第7、14、21天时DG、SVZ的BrdU阳性细胞荧光强度值和BrdU+β-Tubulin、BrdU+GFAP免疫组化双标荧光强度值均高于缺血对照组,差异极显著(P<0.001)。通心络大剂量组第7、14、21天时荧光值均高于通心络小剂量组,差异极显著(P<0.001)。表明通心络干预的第7天起,缺血侧DG、SVZ神经干细胞开始大量增殖,部分增殖细胞分化为神经元和星形胶质细胞,并持续到缺血后第21天,而以通心络大剂量组效果更为明显。相关数据见表1、2、3,免疫组化检测结果见图1~4。